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感知質(zhì)膜曲率可以讓遷移細(xì)胞繞過障礙
發(fā)布時間： 2023-11-21 點擊次數(shù)： 1280次概述
為了在不同的組織中導(dǎo)航，遷移細(xì)胞必須平衡持續(xù)的自我推進(jìn)運動與規(guī)避障礙的適應(yīng)性行為。我們確定了類免疫細(xì)胞躲避障礙的曲率傳感機(jī)制。具體來說，我們提出，在質(zhì)膜向內(nèi)彎曲的區(qū)域中，曲率敏感的 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白 Snx33 會抑制遷移細(xì)胞前進(jìn)邊緣的肌動蛋白聚合。這種機(jī)制的遺傳擾動降低了細(xì)胞逃避障礙的能力，同時細(xì)胞在無障礙環(huán)境中遷移得更快、更持久。我們的結(jié)果展示了細(xì)胞如何讀取其表面形貌并利用肌動蛋白和質(zhì)膜生物物理學(xué)來解釋其環(huán)境，從而使它們能夠適應(yīng)性地決定是否應(yīng)該前進(jìn)或轉(zhuǎn)身。根據(jù)我們的發(fā)現(xiàn)，我們提出 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白的天然多樣性可能允許細(xì)胞調(diào)整其曲率傳感機(jī)制以匹配其環(huán)境中的形狀特征。
介紹
細(xì)胞遷移驅(qū)動許多發(fā)育、生理和病理過程。雖然推進(jìn)機(jī)制已廣為人知，但仍不清楚細(xì)胞如何引導(dǎo)其運動以導(dǎo)航復(fù)雜和動態(tài)的環(huán)境1并繞過組織內(nèi)的障礙2 , 3。這些適應(yīng)性行為對于快速且動態(tài)的細(xì)胞類型尤其重要，例如免疫細(xì)胞和傳播腫瘤細(xì)胞?；诩拥鞍椎耐黄鸷推鹋葜g的切換已被證明有助于細(xì)胞發(fā)育中的控制4，但細(xì)胞通常僅表現(xiàn)出富含肌動蛋白的突起，例如片狀偽足和褶邊。它們需要足夠長的壽命，以便細(xì)胞能夠探索并持續(xù)地在周圍環(huán)境中移動，同時又足夠“不穩(wěn)定”，以便它們在遇到障礙時能夠適應(yīng)并改變方向5 , 6。
在遷移過程中，細(xì)胞的最外層邊界(質(zhì)膜)因微環(huán)境的變化而變形。然而，目前尚不清楚膜曲率是否編碼細(xì)胞用來選擇其遷移路徑的信息7、8，或者膜形貌是否只是作用在細(xì)胞表面的力的副作用。許多遷移細(xì)胞確實表達(dá)多種曲率感應(yīng)蛋白，它們可以直接與質(zhì)膜和下面的肌動蛋白細(xì)胞骨架相互作用9。特別是，BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白家族可以促進(jìn)膜曲率傳感。這些蛋白質(zhì)形成新月形膜結(jié)合二聚體，可以感知和產(chǎn)生曲率9、10、11，并且已知通過幾個輔助結(jié)構(gòu)域與肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)因子(例如 Arp2/3 復(fù)合物、福爾明或 Rho GTPases)相互作用9、12。事實上，表面形貌的變化會誘導(dǎo)一些胞質(zhì) BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白募集到高度正(向內(nèi))曲率的區(qū)域13，并且可以觸發(fā)肌動蛋白結(jié)構(gòu)和內(nèi)吞熱點的形成14、15。在這里，我們發(fā)現(xiàn)曲率感應(yīng) BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白 Snx33 抑制肌動蛋白聚合并重新排列 WAVE2 的定位，以限制前緣的持續(xù)存在并引導(dǎo)遷移。通過這種機(jī)制，Snx33 允許細(xì)胞自適應(yīng)地決定是否應(yīng)該向前移動或轉(zhuǎn)身離開。
結(jié)果
Snx33 優(yōu)先被排除在遷移細(xì)胞前緣的向外彎曲的膜區(qū)域之外
在分化過程中，類免疫HL-60細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生顯著變化，啟動快速遷移，并獲得復(fù)雜的膜形貌，類似于體內(nèi)骨髓中發(fā)生的情況16(補充圖1a )。終末分化的運動細(xì)胞(dHL-60 細(xì)胞)在前緣顯示出富含肌動蛋白的板狀偽足和膜皺褶(圖 1a、b)。為了更詳細(xì)地分析膜形貌，我們使用掃描電子顯微鏡(SEM)來觀察天然固定細(xì)胞膜的超微結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，并使用偏振全內(nèi)反射熒光顯微鏡(p-TIRFM)來探測活細(xì)胞中的膜曲率動力學(xué)。我們觀察到彎曲的膜圖案，如通過 SEM 在上部質(zhì)膜中看到的那樣(圖 1c)，這是非常動態(tài)的，如通過 p-TIRFM 在基底質(zhì)膜中觀察到的那樣(圖 1d，補充圖 1b-d和補充視頻 1 )。
圖 1：片狀偽足和曲率敏感蛋白 Snx33 的曲率圖案。
a遷移細(xì)胞的前緣具有復(fù)雜的曲率模式。箭頭表示細(xì)胞運動的方向。線條描繪了復(fù)雜的 3D 環(huán)境。b延時明場成像顯示免疫樣分化的 HL-60 細(xì)胞的遷移。c野生型細(xì)胞的掃描電子顯微鏡 (SEM) 圖像，前緣放大。n = 175。d p-TIRFM 成像的延時 p 偏振顯示前沿的動態(tài)膜波。e分化(遷移)和未分化(非遷移)HL-60 細(xì)胞之間上調(diào)(橙色)和下調(diào)(藍(lán)色)BAR 結(jié)構(gòu)域基因。f細(xì)胞中 z 平面上部(靠近細(xì)胞頂部)和下部(近表面平面)的熒光標(biāo)記 Snx33 (eGFP-Snx33) 和膜標(biāo)記( CAAX-mcherry)。g通過共焦顯微鏡獲得的不同高度的熒光標(biāo)記的 Snx33 和膜標(biāo)記的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。n = 10。誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。h使用 AlphaFold 多聚體(綠色)建模的 Snx33 PX-BAR 結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與不完整晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID：4AKV；灰色)的比較。i在 PX-BAR 質(zhì)心(綠色，平均曲率PX-BAR = 16 μm -1)和隨機(jī)脂質(zhì)磷酸位置(黃色)采樣的平均曲率 (H) 的概率直方圖。顯示了平滑分布的核密度估計。平均值表示為垂直虛線。j具有 PX-BAR 域的屈曲膜的粗粒度模擬快照的俯視圖和側(cè)視圖。顯示了蛋白質(zhì)主鏈珠(綠色)、磷酸鹽珠(黃色球體)和脂質(zhì)尾部(灰色棒)。為了清楚起見，省略了水和離子。顯示了俯視圖和側(cè)視圖。指示各個幀的時間點。k , l使用點陣光片顯微鏡觀察遷移細(xì)胞的橫截面 ( xz )，放大膜皺邊 ( k )和片狀足 ( l ) 上的 eGFP-Snx33 和 CAAX-mcherry 進(jìn)行可視化。n = 6。m Snx33 相對于質(zhì)膜開和關(guān)褶皺的平均z位置的量化( p TopMembrane = 0.01635，t = -3.5524，df = 5，配對，兩側(cè))。n = 6 個單元，其數(shù)據(jù)是從雙色 3D 電影中獲得的。每個點代表 1 個單元格的平均值。比例尺 = 10 μm。p < 0.05 (*)。
這些彎曲的膜圖案可能構(gòu)成曲率敏感蛋白的結(jié)合位點，例如來自 BAR 結(jié)構(gòu)域家族的蛋白。為了從這個大家族中識別出能夠感知凹進(jìn)障礙并因此與細(xì)胞遷移過程中的適應(yīng)性行為相關(guān)的候選者，我們測量了 HL-60 分化為遷移狀態(tài)(即曲率較差(原始細(xì)胞為原始細(xì)胞))之前和之后的表達(dá)譜。均勻圓形)與曲率豐富的狀態(tài)(補充圖 1a)。BAR結(jié)構(gòu)域蛋白Snx33的表達(dá)在此分化過程中增加了16倍(圖 1e)。我們在熒光標(biāo)記(eGFP-Snx33)后通過共聚焦顯微鏡對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行成像，發(fā)現(xiàn)Snx33在整個膜皺褶處富集(圖 1f，g)，即dHL-60細(xì)胞前緣的高度彎曲結(jié)構(gòu)。基于其蛋白質(zhì)家族內(nèi)的相似性，與 BAR 亞組9的許多其他 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)相比，Snx33 預(yù)計會結(jié)合淺曲率。Snx33(PX-BAR)的膜結(jié)合結(jié)構(gòu)域在凸面上包含一個帶正電的斑塊，這強(qiáng)烈表明該表面上存在向內(nèi)曲率依賴性膜結(jié)合(補充圖2a-d )。為了更詳細(xì)地評估其曲率傳感特性，我們對具有質(zhì)膜衍生脂質(zhì)成分的屈曲膜上的 PX-BAR 結(jié)構(gòu)域(圖1h-j)進(jìn)行了長的粗粒度分子動力學(xué)(MD)模擬(表 S1；詳細(xì)信息請參見方法)。這種計算分析已被廣泛用于表征多種蛋白質(zhì)17、18(包括其他 BAR 結(jié)構(gòu)域19 )的曲率傳感特性。在 30 µs 長的模擬過程中，Snx33 的 PX-BAR 結(jié)構(gòu)域仍然與膜緊密結(jié)合，并表現(xiàn)出對具有向內(nèi)局部曲率的膜區(qū)域的強(qiáng)烈偏好(圖 1i，j，補充圖 2e ， f )。Snx33 將質(zhì)膜與賴氨酸和精氨酸等堿性殘基表面結(jié)合，介導(dǎo)靜電相互作用(補充圖 2a –d、3a、b、4a–g，詳細(xì)信息請參閱 補充討論)，這對于質(zhì)膜結(jié)合很常見20 . 為了進(jìn)一步測試 Snx33 在細(xì)胞中的曲率敏感性，我們通過晶格光片顯微鏡對其亞細(xì)胞定位進(jìn)行了成像，并且支持我們的 MD 模擬，我們發(fā)現(xiàn) Snx33 被排除在褶邊和片狀偽足邊緣之外，這兩種結(jié)構(gòu)都具有高度負(fù)性(向外)曲率(圖 1k-m，補充圖 5和補充視頻 2，有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱方法)。為了證實 Snx33 的排除，我們將其定位與 IRSp53(也稱為 BAIAP2)(一種典型的向外曲率結(jié)合蛋白)的定位進(jìn)行了比較21。如前所述，在中性粒細(xì)胞樣細(xì)胞中，IRSp53 積聚在前進(jìn)纖維和回縮纖維22、23的，即已知的向外彎曲結(jié)構(gòu)(補充圖 6a-c和補充視頻 3)?？偠灾覀儽砻?，含有 BAR 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì) Snx33 對具有向內(nèi)局部曲率的膜區(qū)域有強(qiáng)烈的偏好，并且在前緣富集，但被排除在向外彎曲的膜結(jié)構(gòu)之外。
Snx33 控制前沿生長并調(diào)節(jié)質(zhì)膜張力
為了研究 Snx33 在適應(yīng)性遷移中的作用，我們使用 CRISPR/Cas9 基因組編輯生成了 Snx33 敲除 (Snx33-/-) 細(xì)胞系(補充圖 7a、 b)。免疫樣細(xì)胞中的推進(jìn)取決于細(xì)胞前緣肌動蛋白的活性聚合24、25。鑒于細(xì)胞形狀反映了運動驅(qū)動的富含肌動蛋白的突起26的變化，我們對選定的細(xì)胞形態(tài)參數(shù)(即細(xì)胞鋪展、細(xì)胞偏心度和前沿特征)進(jìn)行了定量和公正的比較。由于免疫細(xì)胞在短時間內(nèi)改變其形態(tài)，我們對延時電影進(jìn)行平均以捕捉它們的動態(tài)。為此，我們在 ilastik 27中訓(xùn)練并使用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的算法來分析全內(nèi)反射熒光顯微鏡 (TIRFM) 成像的細(xì)胞影像(詳細(xì)信息請參閱方法)。Snx33-/-細(xì)胞擴(kuò)散到更大范圍，并表現(xiàn)出更細(xì)長的形態(tài)和更大的前緣(圖 2a-f，補充圖 8a-e和補充視頻 4和5)，與基質(zhì)的粘附無關(guān)(補充圖 8f-i)。此外，可以通過表達(dá)熒光標(biāo)記的Snx33來挽救擴(kuò)散面積和前緣面積的增加，證明觀察到的表型的特異性(補充圖 8b，c)?？偠灾@些結(jié)果表明 Snx33-/- 細(xì)胞在遷移過程中具有更穩(wěn)定的前緣。
圖 2：Snx33 敲除細(xì)胞由于肌動蛋白聚合增加而表現(xiàn)出細(xì)胞和前緣形態(tài)的改變。
野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞的 TIRFM 圖像。b細(xì)胞擴(kuò)散面積(p = 1.505e-7，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))和c運動過程中野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞之間的偏心率不同(p = 0.004989，Mann–Whitney- U -測試，雙面)。d野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞的前緣分割。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。e前沿面積(p = 1.634e-5，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))和f長度(p = 0.2111，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))。n = 82(重量)，n = 78(Snx33-/-)。g靜態(tài)系繩拉動實驗示意圖。h 來自 3 個獨立實驗的 wt ( n = 24)、Snx33-/- ( n = 26) 和 Snx33-/- 與過表達(dá) eGFP-Snx33 ( n = 25)的平均靜態(tài)系留力( p wt 與 Snx33-/- = 7.883e-6，t = −5.0144，df = 47.376；p wt 與 Snx33-/- + eGFP-Snx33 = 0.2141，t = −1.2601，df = 45.515；p Snx33-/- 與 Snx33-/- + eGFP-Snx33 = 0.2141，t = -1.2601，df = 45.515，兩側(cè))。i通過流式細(xì)胞術(shù)定量固定 wt 和 Snx33-/- dHL-60 細(xì)胞中鬼筆環(huán)肽熒光強(qiáng)度的中值。來自 3 個獨立實驗的數(shù)據(jù)(p t00 = 0.184，Mann–Whitney- U檢驗，雙邊；p t01 = 0.0373，t = −4.26，df = 2.375，雙邊；p t30 = 0.1298，t = -1.9728 ，df = 3.5035，兩側(cè))。j全長 Snx33 及其結(jié)構(gòu)域和兩個 Snx33 截斷(ΔPXBAR 和 PXBAR)的示意圖。免疫共沉淀實驗中比較 Snx33-/- 與 Snx33-/- + GFP-Snx33、Snx33-/- + GFP-Snx33ΔPXBAR 和 Snx33-/- + GFP-Snx33PXBAR 的火山圖。富集命中(limma p值 ≤ 0.01，倍數(shù)變化 ≥ 50%)顯示為綠色，其余為灰色。比例尺 = 10 μm。p < 0.001 (***), p < 0.01 (**), p < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應(yīng)于第 25 個和第 75 個百分位數(shù)。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數(shù)據(jù)：黑點。黑線：中位數(shù)。黑點：意思。
已知持續(xù)遷移過程中前緣生長和細(xì)胞擴(kuò)散增加會增加質(zhì)膜張力28 , 29。為了測試由 Snx33 損失引起的更穩(wěn)定的前緣是否會導(dǎo)致更高的膜張力，我們使用原子力光譜法通過靜態(tài)系鏈拉力在前緣測量了它，其中質(zhì)膜系鏈保持恒定長度直到斷裂(圖 2g )。我們發(fā)現(xiàn)Snx33-/- dHL-60細(xì)胞中的靜態(tài)系繩力顯著增加(從61.58到75.25 pN，圖 2h)，這對應(yīng)于表觀膜張力幾乎增加了50%(從177.87到265.62 μN/ m；有關(guān)詳細(xì)信息，請參閱方法)。此外，膜張力的增加可以通過穩(wěn)定表達(dá)熒光標(biāo)記的Snx33來挽救，排除Snx33獨立功能作為該表型的起源(圖 2h)。值得注意的是，Snx33-GFP在野生型背景上的過度表達(dá)并沒有降低膜張力，這表明功能的獲得不足以改變前緣或其對膜力學(xué)的影響(補充圖9a )。最后，這些表型不是分化缺陷的結(jié)果，因為中性粒細(xì)胞分化標(biāo)記物 CD11b 在 Snx33-/- 細(xì)胞中不受干擾，也不是 CRISPR/Cas9 技術(shù)生成細(xì)胞系引起的潛在脫靶效應(yīng)的結(jié)果(補充圖 9b ， C)。總而言之，這些結(jié)果證實 Snx33-/- 細(xì)胞具有更穩(wěn)定的前沿，顯示出持久遷移所需的所有特征。
Snx33 調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合
我們的研究結(jié)果表明，曲率感應(yīng)蛋白 Snx33 負(fù)向調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合，從而限制前緣尺寸。因此，我們通過流式細(xì)胞儀添加趨化劑(fMLP)后通過鬼筆環(huán)肽染色定量絲狀肌動蛋白(F-肌動蛋白)的量，并觀察到與野生細(xì)胞相比，Snx33-/-細(xì)胞中F-肌動蛋白的總量顯著增加-型對應(yīng)物(圖 2i)。這表明 Snx33 對肌動蛋白聚合發(fā)揮抑制作用，特別是在刺激后的最初爆發(fā)期間。但是 Snx33 是如何抑制肌動蛋白聚合的呢？一些 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白通過直接結(jié)合肌動蛋白或通過招募激活肌動蛋白相關(guān)蛋白 2/3 (Arp2/3) 復(fù)合物的成核促進(jìn)因子 (NPF) 來重塑肌動蛋白9 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34。為了了解 Snx33 如何抑制肌動蛋白聚合，我們在敲除背景中共免疫沉淀全長 GFP-Snx33 及其結(jié)合伴侶，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。由于BAR結(jié)構(gòu)域蛋白之間普遍存在分子內(nèi)自抑制相互作用，因此我們還對含有或缺失PX-BAR結(jié)構(gòu)域但跨越全長蛋白的Snx33的兩個截短物進(jìn)行了共免疫沉淀(圖2j )。Arp2/3復(fù)合體的幾個成員以及加帽蛋白的兩個亞基與Snx33共免疫沉淀(limma p值 ≤0.01 ，倍數(shù)變化≥50%)(圖2j)。特別是，我們在全長 GFP-Snx33 或其截短物中發(fā)現(xiàn)了 ARPC2、ARPC4-TTLL3、ACTR2、ACTR3、CAPZA1 和 CAPZB1 的正倍數(shù)變化，表明 Snx33 與 Arp2/3 復(fù)合物和加帽蛋白結(jié)合。Arp2/3 復(fù)合體是肌動蛋白成核劑，負(fù)責(zé)中性粒細(xì)胞前緣的片狀偽足和皺褶形成35，而加帽蛋白通過與肌動蛋白絲結(jié)合來終止肌動蛋白絲的生長，并通過 Arp2/3 復(fù)合體增強(qiáng)其分支36，37、38、39。_ _ _ _ 有趣的是，我們可以觀察到，與全長蛋白相比，一些 Arp2/3 組件和加帽蛋白亞基的任一結(jié)構(gòu)域都顯著富集(補充圖 10a)，這表明 Snx33 的不同結(jié)構(gòu)域以不同的親和力結(jié)合它們，可能 是因為自抑制相互作用可能會遮擋結(jié)合位點或影響膜結(jié)合，如其他 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白的報道40 , 41 , 42?？傊?，Snx33 可能通過調(diào)節(jié) Arp2/3 復(fù)合物和/或加帽蛋白來負(fù)向調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合。
Snx33 影響 WAVE2 定位和褶邊形態(tài)
WAVE2 是中性粒細(xì)胞中 Arp2/3 復(fù)合體上游已知的肌動蛋白 NPF 24、35。因此，為了進(jìn)一步表征 Snx33-/- 細(xì)胞的前緣，我們在 TIRFM 遷移過程中對 WAVE2 復(fù)合體 (Hem-1) 的一個組成部分(以下稱為 WAVE2)進(jìn)行了成像(圖 3a 和補充 視頻6 和7 )。WAVE2 因其在細(xì)胞遷移過程中定位于基底膜上的波而得名24。為了產(chǎn)生這樣的模式，WAVE2 波在其尾跡中沉積一種抑制劑，暫時抑制 WAVE2 募集24。有趣的是，聚合肌動蛋白是這種抑制反饋的關(guān)鍵組成部分，但調(diào)節(jié) WAVE2 與膜結(jié)合并決定其斑塊形態(tài)的因素仍然知之甚少43。因此，我們使用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的分割來量化 WAVE2 模式特征。引人注目的是，Snx33-/- 細(xì)胞的 WAVE2 面積及其質(zhì)膜斑塊的大小增加了 40%(圖 3b-d)。為了確定這是由于 WAVE2 成分表達(dá)水平的差異還是由于膜結(jié)合增加所致，我們進(jìn)行了 RNAseq。與對照細(xì)胞相比，我們觀察到 Snx33-/- 細(xì)胞的表達(dá)沒有差異或有非常微小的差異(補充圖 10b)，這表明 Snx33 影響 WAVE2 復(fù)合物的定位而不是其表達(dá)。這是特別有趣的，因為迄今為止，僅報道了非常劇烈的 WAVE2 補丁表型，這導(dǎo)致遷移能力嚴(yán)重破壞44 , 45。接下來，我們試圖測試 WAVE2 斑塊形態(tài)變化與前沿形態(tài)的功能相關(guān)性。為此，我們從SEM圖像中量化了有效褶邊波長，并觀察到與野生型細(xì)胞相比，Snx33-/-細(xì)胞的褶邊排列明顯不那么緊密(圖3e，f，補充圖8j， 補充圖 8j ) . 11a ). 最后，為了確定有效皺邊波長的增加是否僅僅是 Snx33-/- 細(xì)胞膜張力增加的結(jié)果，我們對 PLD2 敲低 (KD) 細(xì)胞進(jìn)行了 SEM，該細(xì)胞也顯示膜張力增加44。值得注意的是，與 Nonsense 細(xì)胞相比，PLD2 KD 細(xì)胞的有效褶皺波長沒有差異(補充圖 11b、c)。這些發(fā)現(xiàn)將 Snx33 確定為膜形狀與調(diào)節(jié)膜形狀的肌動蛋白聚合因子之間的聯(lián)系。
圖 3：Snx33 敲除細(xì)胞中 WAVE2 圖案寬度和褶皺波長增加。
野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞的 TIRFM 圖像顯示了 WAVE2 的分布，WAVE2 是中性粒細(xì)胞中 Arp2/3 復(fù)合物上游的肌動蛋白成核促進(jìn)因子。b前緣 WAVE2 斑塊占據(jù)的總面積在 Snx33 丟失后增加(p = 0.000408，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))。n = 82(重量)，n = 78(Snx33-/-)。c野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞中動態(tài) WAVE2 斑塊的分割。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。d當(dāng) Snx33 丟失時，WAVE2 斑塊的大小會增加(p = 0.000464，Mann–Whitney- U檢驗，雙面)。n = 82(重量)，n = 78(Snx33-/-)。帶有皺褶分割的 SEM 圖像(紅色)顯示了分布第50 個百分位數(shù)的野生型和 Snx33-/- 細(xì)胞的前緣。f有效褶邊波長隨著 Snx33 的損失而增加(p = 3.171e-7，Mann–Whitney- U測試，雙面)。n = 175(重量)，n = 170(Snx33-/-)。統(tǒng)計：t檢驗或非參數(shù) Mann–Whitney- U檢驗。比例尺 = 10 μm。p < 0.001 (***)、p < 0.01 (**)、p < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應(yīng)于第 25 個和第 75 個百分位數(shù)。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數(shù)據(jù)：黑點。黑線：中位數(shù)。黑點：意思。
Snx33 支持曲率相關(guān)的物體躲避
迄今為止，我們的數(shù)據(jù)表明膜曲率結(jié)合蛋白 Snx33 調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合、前沿形態(tài)和穩(wěn)定性。前緣圖案可以通過減少持久性和促進(jìn)隨機(jī)規(guī)避動作來促進(jìn)適應(yīng)性運動。但 Snx33 介導(dǎo)的膜肌動蛋白耦合的特殊形式表明了一種額外的、更直接的效應(yīng)，其中推進(jìn)力特別是在細(xì)胞路徑中可能存在障礙的情況下減少，即外部壓痕產(chǎn)生增加的分?jǐn)?shù)具有向內(nèi)彎曲的區(qū)域。因此，Snx33 可以促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)向，因為碰撞產(chǎn)生的膜變形會局部下調(diào)推進(jìn)力，從而重新定向前緣。為了檢驗這個假設(shè)，我們首先將細(xì)胞定位在微流體裝置46、47中，它們在其中遷移通過通道并遇到不同尺寸孔形式的障礙物。Snx33-/- dHL60 細(xì)胞需要比野生型細(xì)胞多幾乎 20% 的時間來導(dǎo)航這些決策點并找到阻力最小的路徑(圖 4a，補充圖 12a、b 和補充 視頻8 )。由于細(xì)胞核已被證明可以作為沿著最小阻力路徑的機(jī)械引導(dǎo)46，因此我們通過原子力壓痕測量了核剛度，并排除了 Snx33-/- 細(xì)胞中核力學(xué)受到的影響(補充圖 12c，d) ，與它們保留的讀取孔徑的能力一致(補充圖 12b)。然而，在無決策通道中，Snx33-/-細(xì)胞的遷移速度比野生型細(xì)胞快80%，包括在通過單個收縮通道期間(圖4b、 補充圖 12e和補充視頻 9)。接下來，我們用均質(zhì)化學(xué)引誘劑量化了 2D 平面基底上的無限制遷移，促進(jìn)細(xì)胞運動，而不需要細(xì)胞適應(yīng)任何障礙(圖 4c，詳細(xì)信息請參閱方法 )。與在無決策通道中一樣，Snx33-/-細(xì)胞比野生型細(xì)胞遷移得更快(圖 4d)。此外，雖然Snx33-/-細(xì)胞的運動性更持久，但野生型細(xì)胞更傾向于進(jìn)行大的自發(fā)轉(zhuǎn)動(圖 4e)。因此，Snx33的缺失似乎使細(xì)胞不太容易自發(fā)轉(zhuǎn)動，并且在繞行物體時效率較低，同時在無決策環(huán)境中表現(xiàn)出更持久的遷移。這些遷移表型與我們在 Snx33-/- 細(xì)胞中觀察到的前緣尺寸和質(zhì)膜張力的增加一致(圖 2d-h))?？傊?，這些觀察結(jié)果表明 Snx33-/- 細(xì)胞的推進(jìn)能力有所提高，但在面臨障礙時缺乏適應(yīng)能力。
圖 4：Snx33 通過抑制 WAVE2 復(fù)合物來引導(dǎo)單細(xì)胞 2D 和 3D 遷移中的細(xì)胞運動。
a細(xì)胞中的決策通道通過時間(n wt = 159，平均值 = 1.67 分鐘；n Snx33-/- = 9；平均值 = 1.96 分鐘)(p = 0.02，Mann–Whitney- U -測試，兩側(cè))。b細(xì)胞中的收縮通過時間(n wt = 234，n Snx33-/- = 158)(p = 2.2e-16，Mann–Whitney- U-檢驗，兩側(cè))。c wt 和 Snx33-/- 細(xì)胞中細(xì)胞體隨時間的位移。時間范圍(5 秒)采用顏色編碼。d wt 和 Snx33-/- 細(xì)胞的細(xì)胞速度(p = 7.661e-5，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))e細(xì)胞在遷移過程中轉(zhuǎn)動的角度分布(p = 0.0007583，Mann–Whitney- U測試，雙面)。N wt = 82，n Snx33-/- = 78。數(shù)據(jù)來自 3 個獨立的生物重復(fù)。f兩個 wt 或 Snx33-/- dHL-60 細(xì)胞之間接觸事件的分割。陰影突出顯示接觸持續(xù)時間。g wt (n = 18) 和 Snx33-/- ( n = 20) dHL-60 細(xì)胞中與另一個細(xì)胞接觸的細(xì)胞周長百分比 (p = 0.0001704，Mann–Whitney- U檢驗，兩側(cè))。h使用各種技術(shù)測量的曲率大小的可視化。i通過 SBEM 成像顯示單個和碰撞的遷移 dHL-60 細(xì)胞的橫截面。N single = 6，n collided = 6。j單個和碰撞遷移單元前緣絕對曲率值的可視化(來自i)。k直方圖，顯示單個像元和碰撞像元前緣的絕對曲率值分布(n個單個像元 = 6，n 個碰撞像元 = 6)。數(shù)據(jù)點表示每個單元格的平均值。lxy平面的單個和碰撞的遷移 dHL-60 細(xì)胞的膜標(biāo)記 (CAAX)，通過點陣光片繪制。m單個和碰撞遷移細(xì)胞前緣絕對曲率值的可視化(來自l)。n直方圖顯示晶格光片圖像中單個細(xì)胞和碰撞細(xì)胞前緣的絕對曲率(n個單個 = 5，n個碰撞 = 5)。數(shù)據(jù)點表示每個單元格的平均值。o帶有熒光標(biāo)記的 Snx33 和 Hem1 的 wt dHL-60 細(xì)胞中細(xì)胞與細(xì)胞接觸的明場和p TIRFM 成像。箭頭指向細(xì)胞與細(xì)胞的接觸。n = 3. q WAVE2 在 wt (n = 9) 和 Snx33-/- ( n = 10) dHL-60 細(xì)胞中細(xì)胞接觸后的倍數(shù)變化( p = 0.01816, t = -2.5877, df = 18.789, 兩個雙面)。比例尺 = 10 μm。p < 0.001 (***)、p < 0.01 (**)、p < 0.05 (*)。箱線圖：下鉸鏈和上鉸鏈對應(yīng)于第 25 個和第 75 個百分位數(shù)。上部須線從鉸鏈延伸至最大值，但不超過 1.5*IQR。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。胡須之外的數(shù)據(jù)：黑點。黑線：中位數(shù)。黑點：意思。
為了進(jìn)一步了解 Snx33 缺陷細(xì)胞的物體逃避反應(yīng)，我們設(shè)計了一種還原性測定法來測試接觸運動抑制 (CIL)，這是許多細(xì)胞類型(包括 dHL-60s)中的常見現(xiàn)象，其中細(xì)胞停止在當(dāng)它們與另一個細(xì)胞或物體24、48接觸時，它們會朝特定方向移動。為了測試 CIL 作為對細(xì)胞障礙的反應(yīng)是否受 Snx33 控制，我們接種了更高密度的 dHL-60 細(xì)胞，并通過 TIRFM 在細(xì)胞間相互作用的情況下對它們的 2D 遷移進(jìn)行成像。與野生型細(xì)胞相比，Snx33-/-細(xì)胞形成更大的細(xì)胞-細(xì)胞接觸(圖 4f，g)，這與它們在面對惰性障礙時增加的決策時間一致(圖 4a)。我們的計算結(jié)果與觀察到的 Snx33 定位(圖 1h-m)表明優(yōu)先結(jié)合到向內(nèi)彎曲的區(qū)域。為了評估細(xì)胞之間碰撞時質(zhì)膜幾何形狀發(fā)生的變化，我們量化了碰撞后自由移動細(xì)胞和成對細(xì)胞前緣的曲率差異。我們進(jìn)行了連續(xù)塊面掃描電子顯微鏡(SBEM)，手動分割質(zhì)膜，并量化了xz平面中碰撞和單細(xì)胞前面的自由和接觸區(qū)域的曲率(圖 4h- k )。此外，為了排除潛在的固定偽影，我們使用膜標(biāo)記(CAAX)和xy平面上的晶格光片(LLS)成像分析了自由遷移和碰撞活細(xì)胞的前緣(圖4l-n和補充 圖13f ) -我)。在這兩個數(shù)據(jù)集中，我們觀察到單個細(xì)胞和碰撞細(xì)胞之間正面的曲率分布發(fā)生變化。雖然單細(xì)胞表現(xiàn)出偏向外曲率的更廣泛分布，但接觸表面的特征是以零為中心的更窄分布，這與接觸部位的整體平坦化一致。細(xì)胞與細(xì)胞的接觸抑制了正曲率和負(fù)曲率(補充圖 14a-d)。
為了進(jìn)一步剖析 Snx33 在 CIL 中的分子作用，我們同時對活細(xì)胞前緣的中性粒細(xì)胞 WAVE2 復(fù)合物(使用 Hem1)和 Snx33 進(jìn)行成像。雖然這兩種蛋白質(zhì)在很大程度上共定位于細(xì)胞的大部分部分，但它們在前緣的高度負(fù)彎曲邊緣中呈反相關(guān)(補充圖 15a、b)。在這里，Snx33水平下降，而WAVE2積累(補充圖 15c，d)，這與Snx33被排除在向外彎曲區(qū)域之外并限制WAVE與這些區(qū)域的結(jié)合一致。此外，當(dāng)細(xì)胞碰撞時，Snx33定位于細(xì)胞接觸區(qū)域，隨后WAVE2消失并重新定位到質(zhì)膜的無接觸區(qū)域(圖4o，p)。隨后，細(xì)胞通過形成新的前沿而重新極化(圖 4o，p)。為了評估 Snx33-/- 細(xì)胞中功能失調(diào)的 CIL 反應(yīng)是否是由于接觸區(qū)域的 WAVE2 抑制受損所致，我們在 Snx33-/- 細(xì)胞碰撞前后跟蹤了 WAVE2 定位(補充視頻 10 )。與野生型細(xì)胞相比，Snx33-/-細(xì)胞確實未能從接觸位點去除WAVE2(圖 4q和補充圖 15e)?？偠灾?，我們展示了曲率感應(yīng)蛋白 Snx33 在 CIL 期間調(diào)節(jié)肌動蛋白聚合中的關(guān)鍵作用。具體來說，Snx33 取代了細(xì)胞與細(xì)胞接觸區(qū)域的 WAVE，從而在與障礙物碰撞時導(dǎo)致細(xì)胞向無接觸區(qū)域重新極化。
討論
物體逃避不僅是免疫細(xì)胞和癌細(xì)胞在復(fù)雜組織環(huán)境中遷移的關(guān)鍵，而且也是胚胎發(fā)生和體內(nèi)集體遷移的基礎(chǔ)49。結(jié)合遺傳擾動、顯微鏡和微流體，我們發(fā)現(xiàn)了免疫樣細(xì)胞適應(yīng)性運動背后的曲率傳感機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白 Snx33 可以讀出膜曲率景觀的變化，并反饋給肌動蛋白聚合機(jī)制，以調(diào)節(jié)遷移細(xì)胞前緣的復(fù)雜模式。具體來說，Snx33 抑制肌動蛋白聚合并調(diào)節(jié) WAVE2(中性粒細(xì)胞中主要成核促進(jìn)因子)的定位。因此，Snx33 限制了前緣的持續(xù)性并降低了遷移方向性。這種促進(jìn)細(xì)胞遷移過程中自發(fā)重新定向的機(jī)制補充了豐富表達(dá)的 I-BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白的機(jī)制，其中向外曲率傳感與肌動蛋白聚合的局部激活相結(jié)合增強(qiáng)了探索性細(xì)胞行為22。雖然很少有其他 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白含有對肌動蛋白聚合具有抑制作用的結(jié)構(gòu)域，但它們可能并不完全冗余。我們設(shè)想它們的作用機(jī)制將是多種特性的結(jié)果，包括曲率敏感性、結(jié)合強(qiáng)度、結(jié)合伙伴以及存在的其他域。因此，BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白成為多功能工具，可以局部激活或抑制肌動蛋白聚合，從而賦予細(xì)胞對其前緣的功能控制。
自發(fā)地重新定向和探索具有動態(tài)突出物的微環(huán)境的能力本身有助于在擁擠的環(huán)境中更有效地導(dǎo)航6,22,44,46,50,51。此外，突出活動的曲率依賴性下調(diào)還可以通過引導(dǎo)細(xì)胞遠(yuǎn)離外部最有可能存在障礙物的方向，更直接地幫助躲避物體。事實上，我們證明 Snx33 是細(xì)胞繞過惰性障礙和細(xì)胞障礙并從而在復(fù)雜的三維環(huán)境中遷移的關(guān)鍵。迄今為止，人們對協(xié)調(diào) CIL 的分子機(jī)制知之甚少。srGAP2 是一種結(jié)合向外膜曲率的 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白，顯示在 CIL 52、53、54、55期間誘導(dǎo)突出。我們的研究表明，向內(nèi)彎曲感應(yīng)蛋白 Snx33 在抑制 CIL 期間肌動蛋白聚合方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。具體來說，我們表明多結(jié)構(gòu)域蛋白 Snx33 定位于細(xì)胞與細(xì)胞接觸并將 WAVE2 重新分配到自由表面，從而重新定向細(xì)胞。這可能以依賴于曲率的方式發(fā)生，因為Snx33優(yōu)先定位于向內(nèi)彎曲的膜區(qū)域，而WAVE2被限制于前緣23處的向外彎曲的區(qū)域。在細(xì)胞與細(xì)胞接觸處，我們使用測量曲率值相差一個數(shù)量級的兩個數(shù)據(jù)集來識別曲率分布的明顯變化。具體而言，碰撞時，曲率分布比遷移單細(xì)胞的自由前緣的曲率分布更窄，這與碰撞時膜變平一致。Snx33 PX-BAR 二聚體的預(yù)期曲率靈敏度對應(yīng)的曲率高于細(xì)胞-細(xì)胞碰撞時測量的曲率。然而，值得注意的是，BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白具有輔助結(jié)構(gòu)域，可以形成寡聚體以及線性聚集體，以相當(dāng)?shù)偷那?6、57、58結(jié)合膜。此外，我們對細(xì)胞的觀察僅限于曲率半徑，其大小高于各自的圖像分辨率極限，并受到可檢測的曲率長度尺度的限制。因此，在未來，探索形成組裝以及輔助結(jié)構(gòu)域的存在/不存在如何允許 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白跨越更大的曲率半徑以響應(yīng)分子復(fù)雜性內(nèi)膜形狀的更大規(guī)模變化將是很重要的。細(xì)胞19 , 59。
在這里，我們表明 Snx33 對肌動蛋白聚合的調(diào)節(jié)對細(xì)胞遷移具有重要影響。這與 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白固有的曲率傳感特性以及 CIL 期間細(xì)胞間碰撞時觀察到的膜曲率分布變化相結(jié)合，表明膜曲率改變直接適應(yīng)性細(xì)胞行為的機(jī)制?？傊?，我們的研究支持了這樣的觀點：細(xì)胞利用其膜地形來編碼有關(guān)它們遇到的外部環(huán)境的信息。
鑒于細(xì)胞中存在的 BAR 結(jié)構(gòu)域蛋白的多樣性，我們預(yù)計這種調(diào)節(jié)原理可能用于許多必須對形狀變化做出反應(yīng)的生物功能，從亞細(xì)胞水平(細(xì)胞器穩(wěn)態(tài)、膜運輸)，通過單-細(xì)胞水平(免疫監(jiān)視、腫瘤傳播)到多細(xì)胞水平(原腸胚形成、組織折疊)。
方法
細(xì)胞培養(yǎng)
HL-60 細(xì)胞在含有 10% 熱滅活 FBS (#10500-064, Gibco) 和 1% 青霉素-鏈霉素 (#15140-122, Gibco) 的 RPMI 1640 培養(yǎng)基中于 37 °C、5% 的加濕培養(yǎng)箱中生長二氧化碳2。通過添加 1.5% DMSO(#D2438，Sigma Aldrich)來分化細(xì)胞，并在 5 天后使用。每個獨立區(qū)分的批次被視為生物復(fù)制。對于饑餓，將細(xì)胞在含有 0.3% 無脂肪酸 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)的無 FBS RPMI 1640 培養(yǎng)基中保存 1 小時。為了成像或固定，將 dHL-60 細(xì)胞鋪在纖連蛋白包被的(0.01 mg/ml，#356008，Corning)玻璃底培養(yǎng)皿(#627860，Greiner bio-one)上，并在生長培養(yǎng)基中粘附 10 分鐘。接下來，洗滌細(xì)胞并用 10 nM fMLP(#F3506-5MG，Sigma Aldrich)刺激。為了降低粘附力，涂層中添加了 5% 摩爾 BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。為了生成帶有熒光標(biāo)記的 Snx33 及其截短物(PXBAR 和 ΔPXBAR)以及 Hem1 和 CAAX 的穩(wěn)定細(xì)胞系，如前所述使用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)44。細(xì)胞在 EMBL 流式細(xì)胞術(shù)核心設(shè)施的 BD FACS Aria™ Fusion 上進(jìn)行分選。
通過 CRISPR/Cas9 產(chǎn)生敲除細(xì)胞系
如前所述，在 HL-60 細(xì)胞中進(jìn)行 CRISPR/Cas9 生成45。簡言之，將靶指導(dǎo)序列克隆至靶Snx33 ，進(jìn)行60、61(正向：CACCGctgggacgacGGATGCACAG；反向：aaacCTGTGCATCCgtcgtcccagC )。表達(dá) BFP 標(biāo)記的 Cas9 的細(xì)胞在 EMBL 流式細(xì)胞術(shù)核心設(shè)施的BD FACS Aria TM Fusion上的 96 孔板中進(jìn)行單細(xì)胞分選。單細(xì)胞克隆通過 Touchdown PCR 62 的基因組 DNA 擴(kuò)增和測序進(jìn)行驗證，然后對選定的克隆系進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。
RNA測序
根據(jù)制造商的說明，使用 RNeasy Mini Kit(#74104，Qiagen)純化從 3 個生物重復(fù)獲得的總 RNA 樣品，并進(jìn)行 DNase 消化步驟(#79254，Qiagen)。為了確保高質(zhì)量，樣品在 Agilent 2100 生物分析儀(Agilent Technologies)上進(jìn)行分析。RNA 測序是在 EMBL 基因組學(xué)核心設(shè)施的 Illumina NextSeq 500 平臺(NextSeqHigh-75 SE)上進(jìn)行的。為了進(jìn)行序列比對，使用了 hg19 參考基因組。使用 DESeq2 軟件包通過定制 Galaxy 管道進(jìn)行差異表達(dá)分析。RNAseq 數(shù)據(jù)已存入 BioStudies 的 ArrayExpress 館藏，登錄號為E-MTAB-12436。
影像學(xué)
活細(xì)胞的 TIRFM 圖像是在 Nikon Ti Eclipse 倒置顯微鏡上采集的，配有 CFI Plan Apo Lambda 100x Oil(#MRD01905，尼康)硅膠物鏡和由 NIS-Elements(尼康)控制的 sCMOS 相機(jī)。使用自動對焦系統(tǒng)(Perfect Focus，尼康)進(jìn)行延時成像可減少樣品漂移。
固定細(xì)胞的共焦圖像是在 EMBL 先進(jìn)光學(xué)顯微鏡設(shè)施的 Olympus FV3000 倒置顯微鏡上使用 UPLSAPO 60X S(NA 1.3；WD 0.3 mm)硅膠物鏡獲得的。
使用 40 倍物鏡(#MRD00405，尼康)、SOLA SE II 和 100 W 鹵素?zé)?尼康)并使用適當(dāng)?shù)臑V光片組，對固定細(xì)胞進(jìn)行落射熒光和明場成像。
偏振 TIRFM (pTIRFM) 模式是在以前的工作63、64、65、66、67、68的基礎(chǔ)上實施的。為了成像，在用碳花青染料 DiI(#D3911，ThermoFisher Scientific)鋪板前對 dHL-60 細(xì)胞進(jìn)行染色。
使用適當(dāng)?shù)臑V光片組和 10 × 550 μm 基光束，在 Zeiss Lattice Light Sheet 7(Zeiss，Oberkochen，德國)上進(jìn)行活細(xì)胞的點陣光片成像。
圖像分析
對于共焦圖像(圖 1g和補充圖 15b)，基于覆蓋整個重新切片最大強(qiáng)度 z 投影的線掃描，僅考慮包含 mCherry-CAAX 最高 80% 強(qiáng)度的z平面。感興趣的通道 (ChoF1) 用于基于自動 Otsu 分割的掩模生成。定制的 ImageJ 腳本允許我們使用內(nèi)置的 Coloc2 ImageJ 插件，基于 ChoF1 的掩碼，計算 ChoF1 和 ChoF2 的每個z平面的皮爾遜相關(guān)系數(shù) (PCC)。Z切片被分配到 10 個箱，并計算每個箱的平均值以及平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。
為了分析 TIRFM 成像的遷移細(xì)胞(圖 2b-f、圖 3b-d和圖 4c-e)，細(xì)胞掩模(基于 mCherry-CAAX 信號)和 WAVE2 掩模(基于eGFP-Hem1 信號)是使用基于機(jī)器學(xué)習(xí)的 ilastik 軟件(版本 1.3.1b1 和 1.3.3post3)獲取的27。使用 Python 實現(xiàn)的內(nèi)部構(gòu)建程序?qū)崿F(xiàn)了進(jìn)一步的圖像分析。根據(jù)連續(xù)三個幀的質(zhì)心計算細(xì)胞移動的角度。前沿被定義為兩個連續(xù)幀之間的差異，其中每個簇存在至少一個 WAVE2 掩模像素。前緣長度定義為前緣外周的像素數(shù)。為了分析細(xì)胞-細(xì)胞接觸，使用相同的分割策略來分割單個細(xì)胞。細(xì)胞-細(xì)胞接觸被定義為兩個細(xì)胞的周界相交。
對于SEM數(shù)據(jù)的膜形貌分析(圖 3e，f，補充圖 8j，補充圖 11a-c)，在中值濾波圖像上手動分割帶有褶邊的前緣區(qū)域。接下來，使用Meijering濾波器69在分割區(qū)域內(nèi)檢測脊。隨后使用自動 Otsu 閾值對脊進(jìn)行分割，并使用自定義 Python 腳本進(jìn)行骨架化。每個前緣區(qū)域的骨架化內(nèi)的像素數(shù)量的反轉(zhuǎn)對應(yīng)于有效褶皺波長。
為了分析 SBEM 和晶格光片圖像的膜曲率(圖 4i-n和補充圖 13b-e、g、i)，在前緣(定義為質(zhì)膜前面的區(qū)域)手動分割質(zhì)膜。核)或分別使用帶有膜信號的熒光通道上的 Otsu 閾值進(jìn)行分割，然后進(jìn)行手動管理。接下來，使用自定義 Python 腳本，通過將圓擬合到具有用戶定義長度(指定半寬的 2 倍 + 1 像素)的窗口，沿著分段膜滑動來量化曲率。為了確定曲率的符號，將基準(zhǔn)點手動添加到圖像中以指向細(xì)胞內(nèi)部(補充圖 14a-d)。
為了根據(jù)點陣光片圖像(圖 1m和補充圖 5)分析與膜相關(guān)的蛋白質(zhì)位置，僅在 MIP 中具有可見膜皺褶的細(xì)胞包含在分析中。通過 Mejiering 過濾和 Otsu 閾值處理，在 MIP 中對褶邊進(jìn)行分割。對于用戶定義的 ROI 中的所有像素，提取膜和 Snx33 通道的z線并標(biāo)準(zhǔn)化為其峰值強(qiáng)度。為了解釋不同x – y位置處細(xì)胞厚度的變化，通過定位與頂部和底部細(xì)胞膜相對應(yīng)的膜通道中的峰值來對z線進(jìn)行歸一化(所有檢測到超過 2 個峰值的z線均被排除在外)分析)。然后將歸一化的z線分成對應(yīng)于底部和頂部細(xì)胞膜的兩半，然后通過計算Snx33和膜通道之間的重疊來評估每一半的Snx33共定位。所有顯示低重疊的z線半部均被排除在進(jìn)一步分析之外。接下來，將對應(yīng)于一個細(xì)胞的所有z線合并并分成褶邊內(nèi)組和褶邊外組以及頂膜和底膜亞組。為了允許在褶邊內(nèi)和褶邊外組之間進(jìn)行無偏比較，調(diào)整每組中的z線分布以包含相同頻率的單元厚度。實際上，由于褶邊外組比褶邊內(nèi)組包含更多的z線，所以對褶邊外組進(jìn)行隨機(jī)二次采樣以重構(gòu)褶邊內(nèi)組中的分布。最后，由于單個z線的 SNR不允許準(zhǔn)確評估 Snx33 到膜的距離，我們采用 bootstrap 進(jìn)行平均，其中對每組中的隨機(jī) 100 個z線進(jìn)行平均并重新標(biāo)準(zhǔn)化為其峰值強(qiáng)度。然后測量膜通道和 Snx33 通道中信號首次達(dá)到 20% 的位置之間的距離。然后多次重復(fù)此過程以生成捕獲原始數(shù)據(jù)異質(zhì)性的距離分布。對于每個細(xì)胞，提取 4 個亞組中每個亞組的平均值，并對它們進(jìn)行比較以驗證該方法的穩(wěn)健性。
基于 PDMS 的設(shè)備中的細(xì)胞遷移測定
基于PDMS的微流體裝置的制備如前所述46、70、71。用于遷移 dHL-60 細(xì)胞的裝置的決策點通道和收縮通道的高度分別為 2.8 和 3.13 μm。決策通道在兩種排列中具有 2、3、4 和 5 μm 的收縮。具有單個收縮的通道為2μm。為了可視化細(xì)胞核和細(xì)胞體，在將細(xì)胞引入 PDMS 裝置之前添加 Hoechst 33342(#62249，Thermo Fisher Scientific)和 TAMRA(Invitrogen)。使用配備 Lumencor 光源(390 nm、475 nm、542/575 nm)、孵育室和帶有CO 2的加熱臺。使用 ImageJ 分析獲取的數(shù)據(jù)并手動整理。僅考慮移動穿過整個通道的單個細(xì)胞進(jìn)行分析。所有參數(shù)均根據(jù)核信號進(jìn)行量化。
使用原子力光譜進(jìn)行系鏈擠出
通過擠壓質(zhì)膜系鏈來測量表觀膜張力。為了進(jìn)行測量，將 Bruker 的 Olympus BioLever ( k = 60 pN/nm) 安裝在帶有 JPK SPM 軟件 6.1.183 的 CellHesion 200 AFM (Bruker) 上，該軟件集成到 Eclipse Ti 倒置光學(xué)顯微鏡 (Nikon) 中。使用熱噪聲方法校準(zhǔn)懸臂并涂有 2.5 mg/ml Concanavalin A(#C5275，Sigma Aldrich)。測量之前，用 dPBS 沖洗懸臂。對于系繩測量，將懸臂放置在細(xì)胞上方，最好放置在前緣上方。靜態(tài)系繩拉動實驗的測量參數(shù)如下：接近速度設(shè)置為1μm/s，接觸力設(shè)置為100-300pN，接觸時間設(shè)置為5-10s，回縮速度設(shè)置為10μm/s。拉動 10 μm 的系繩后，懸臂位置保持不變直至斷裂，但不超過 30 秒。在每次實驗重復(fù)中，條件的順序都是隨機(jī)的。對于每個細(xì)胞，至少進(jìn)行 3 次不同的系鏈測量。
使用JPK數(shù)據(jù)處理軟件6.1.183進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。為了根據(jù)系繩力測量來評估膜張力的大小，使用了以下公式44：
?=?028??2
(1)
其中F 0是 AFM 測量的系繩力，B是質(zhì)膜的彎曲剛度，我們假設(shè)它在不同的實驗條件之間保持不變( 基于之前的測量72 , 73為 2.7 × 10 -19 Nm )。
fMLP 刺激后非貼壁 dHL-60 細(xì)胞的 F-肌動蛋白染色
通過向生長培養(yǎng)基中的10 6 個細(xì)胞添加等體積的2x固定緩沖液來饑餓并固定細(xì)胞，或用10 nM fMLP刺激并在刺激后0、1和30分鐘固定。固定緩沖液 (1x) 含有 3.7% 多聚甲醛(#28908，Thermo Scientific)、1x 細(xì)胞內(nèi)緩沖液(140 mM KCL、1 mM MgCl 2、2 mM EGTA、20 mM HEPES，pH 7.5)、320 mM 蔗糖 (#S0389-500G ，Sigma Aldrich)和 0.2% BSA(#A7030-10G，Sigma Aldrich)。接下來，通過板離心，用 1x 細(xì)胞內(nèi)緩沖液小心洗滌細(xì)胞，并在含有 0.2% Triton X-100(#T8787，Sigma Aldrich)的細(xì)胞內(nèi)緩沖液(1x)中用與 TRITC(#P1951，Sigma Aldrich)偶聯(lián)的鬼筆環(huán)肽染色 1 小時)。然后再次用細(xì)胞內(nèi)緩沖液(1x)洗滌細(xì)胞。最后，將它們重懸于 1 ml 0.1% BSA、2.5 mM EDTA 的 dPBS 中，并在 EMBL 流式細(xì)胞術(shù)核心設(shè)施中使用 Cytek® Aurora (Cytek) 進(jìn)行分析。使用 FlowJo 軟件(版本 10.9.0)進(jìn)一步分析數(shù)據(jù)并繪制圖表。
免疫共沉淀
對于免疫共沉淀，通過病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分選將 GFP 標(biāo)記的 Snx33 及其截短物添加到 Snx33-/- 細(xì)胞系中。按照補充有蛋白酶抑制劑(#gtd，Chromotek)的 ChromoTek GFP-Trap Magentic Particles M-270 后，按照細(xì)胞質(zhì)蛋白的建議進(jìn)行 dHL-60 細(xì)胞的收獲和裂解。過夜旋轉(zhuǎn)后，使用 GFP-nanotrap 珠子從裂解物(全長 Snx33 和兩個截短：PXBAR 和 ΔPXBAR)中沉淀 GFP 標(biāo)記的蛋白質(zhì)。在 2xSDS 樣品緩沖液中進(jìn)行洗脫并提交進(jìn)行質(zhì)譜分析。
蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析
樣品制備
使用二硫蘇糖醇(56 °C，30 分鐘，10 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)和 2-氯乙酰胺(室溫，黑暗中，30 分鐘，20 mM，50 mM HEPES，pH 8.5)進(jìn)行還原和烷基化。根據(jù) SP3 協(xié)議制備樣品(https://doi.org/10.15252/msb.20145625、https://doi.org/10.1038/s41596-018-0082-x )。簡而言之，以 1:50 的酶與蛋白質(zhì)比例添加測序級胰蛋白酶 (Promega)，在 37 °C 下過夜消化。通過收集磁體上的上清液并將其與第二次洗脫合并，在 50 mM HEPES(pH 8.5)中進(jìn)行肽回收。
根據(jù)制造商的說明，用 TMT16plex 同量異位標(biāo)記試劑 (ThermoFisher) 標(biāo)記肽。簡而言之，將 0.8 mg 試劑溶解在 42 µl 乙腈 (100%) 中，加入 8 µl 儲備液，并在室溫下孵育 1 小時。將反應(yīng)用 5% 羥胺在室溫下猝滅 15 分鐘。使用 OASIS® HLB µElution Plate (Waters) 合并并凈化樣品。
質(zhì)譜分析
UltiMate 3000 RSLC 納米液相色譜系統(tǒng) (Dionex)，配有捕集柱(μ-Precolumn C18 PepMap 100、5 µm、300 µm 內(nèi)徑 x 5 mm、100 Å)和分析柱(nanoEase™ M/Z HSS T3 色譜柱)使用 Nanospray Flex™ 離子源在正離子模式下將 75 µm x 250 mm C18、1.8 µm、100 Å，Waters)與 Orbitrap Fusion™ Lumos™ Tribrid™ 質(zhì)譜儀(Thermo)耦合。以 30 µl/min(0.05% 三氟乙酸水溶液)的恒定流速將肽濃縮到捕獲柱上 4 分鐘。隨后，使用溶劑 A(0.1% 甲酸水溶液、3% DMSO)以 0.3 µl/min 的恒定流速和逐漸增加的溶劑 B(0.1% 甲酸乙腈溶液， 3% DMSO)在 4 分鐘內(nèi)從 2% 升至 8%，再持續(xù) 104 分鐘從 8% 升至 28%，再用 4 分鐘。從 28% 到 40%，最后 40%–80%，持續(xù) 4 分鐘，然后在 4 分鐘內(nèi)重新平衡回到 2% B。
質(zhì)譜儀參數(shù)如下：噴霧電壓2.4 kV，毛細(xì)管溫度275 ℃，MS1質(zhì)量范圍375~1500 m / z，輪廓模式，軌道阱，分辨率120000。最大填充時間50 ms， AGC 目標(biāo)設(shè)定為標(biāo)準(zhǔn)。將 Orbitrap 的分辨率設(shè)置為 30000，填充時間為 94 ms，離子限制為 1 × 10 5 ，進(jìn)行數(shù)據(jù)相關(guān)采集 (DDA ) 。應(yīng)用歸一化碰撞能量 34。MS2 數(shù)據(jù)是在剖面模式下獲取的。將第一個質(zhì)量固定為 110 m / z。
質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析—Isobarquant
IsobarQuant 74和 Mascot (v2.2.07) 用于處理獲取的數(shù)據(jù)。根據(jù)包含常見污染物和反向序列的智人蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 (UP000005640) 搜索數(shù)據(jù)。搜索參數(shù)中包含以下修飾：脲甲基 (C) 和 TMT10 (K)(固定修飾)、乙?；?蛋白質(zhì) N 端)、氧化 (M) 和 TMT10(N 端)(可變修飾)。對于全掃描 (MS1)，設(shè)置的質(zhì)量誤差容限為 10 ppm；對于 MS/MS (MS2) 譜圖，設(shè)置的質(zhì)量誤差容限為 0.02 Da。設(shè)置了進(jìn)一步的參數(shù)：胰蛋白酶作為蛋白酶，最多允許兩次遺漏切割：最小肽長度為 7 個氨基酸；蛋白質(zhì)鑒定至少需要兩種的肽。肽和蛋白質(zhì)水平的錯誤發(fā)現(xiàn)率設(shè)置為 0.01。
使用 R 編程語言 (ISBN 3-900051-07-0) 分析 IsobarQuant 的原始輸出文件(蛋白質(zhì).txt 文件)。僅具有至少兩個肽的蛋白質(zhì)被包括在分析和定量中?？偣?561 種蛋白質(zhì)通過了質(zhì)量控制過濾器。使用 limma (PMID: 25605792) 清理原始信號和(signal_sum 列)的批次效應(yīng)，然后使用 vsn 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化(方差穩(wěn)定標(biāo)準(zhǔn)化 - PMID：12169536)。為了測試蛋白質(zhì)的差異富集，使用了 limma 包。重復(fù)信息作為設(shè)計矩陣中的一個因素附加到 limma 的“lmFit”函數(shù)的參數(shù)中。命中被定義為錯誤發(fā)現(xiàn)率 (fdr) 小于 5% 且倍數(shù)變化至少 100% 的蛋白質(zhì)，以及 fdr 低于 20% 且倍數(shù)變化至少 50% 的候選蛋白。質(zhì)譜蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)已通過 PRIDE 75合作伙伴存儲庫存入 ProteomeXchange 聯(lián)盟，數(shù)據(jù)集標(biāo)識符為 PXD033666。
分子動力學(xué)模擬
粗粒度分子動力學(xué)模擬
使用 GROMACS 2021.4 76進(jìn)行分子動力學(xué)模擬，使用粗粒度 Martini2.2 力場77 , 78并對所有蛋白質(zhì)珠應(yīng)用既定的縮放程序 (alpha = 0.7) 79 。
作為結(jié)構(gòu)模型的基礎(chǔ)，使用了 Snx33 膜結(jié)合域 (PX-BAR) 的現(xiàn)有晶體結(jié)構(gòu) (PDB ID: 4AKV)。由于該結(jié)構(gòu)中缺少一些環(huán)，我們使用默認(rèn)設(shè)置的 AlphaFold-multimer 80、81預(yù)測了相同的序列，但將循環(huán)次數(shù)增加到 6。所得模型與晶體結(jié)構(gòu)非常一致(RMSD：2.3 Å)，并且直接用于模擬。結(jié)構(gòu)模型是粗粒度的，使用“martinize.py”腳本78應(yīng)用 DSSP 分配的二級結(jié)構(gòu)約束，并使用跨兩個子單元的彈性網(wǎng)絡(luò)82 ，其中f c = 500 kJ/mol −2和截止c = 1.2 nm 如先前報道的其他擴(kuò)展 BAR 蛋白的模擬19。對于所有無序線圈區(qū)域，所有彈性鍵均被移除。
然后將蛋白質(zhì)置于彎曲膜上，該膜是根據(jù)以下程序壓縮平坦膜而產(chǎn)生的。瘋狂的計算脂質(zhì)組學(xué)：用于生成用于分子模擬的定制膜的多功能工具。 J.化學(xué)。 理論計算。 11, 2144–2155 (2015)。">使用“insane.py”工具83制備尺寸為70 x 35 x 20 nm 3的平坦對稱雙層。使用通過質(zhì)譜測定的質(zhì)膜衍生的脂質(zhì)組合物作為輸入(表 S1)。將膜溶劑化并添加Na +離子以使系統(tǒng)電荷中性。然后使用最陡下降算法 1000 步將膜能量最小化。
隨后，使用 Berendsen 恒壓器84和速度重新調(diào)節(jié)恒溫器85在 NPT 系綜(半各向同性壓力耦合)中以 20 fs 的時間步長對雙層進(jìn)行模擬 50 ns 。分別使用 1 ps 和 4 ps 的耦合時間。所有模擬中的溫度均設(shè)置為 310 K。采用Verlet鄰居搜索算法更新鄰居列表，長度和更新頻率自動確定。Lennard-Jones 力和庫侖力在r c = 1.1 nm處截止 ，使用 Verlet 位移電位調(diào)節(jié)器將電位移至 0 86。
然后，將側(cè)向壓力設(shè)置為 10 bar 以生成屈曲膜結(jié)構(gòu)(P x,y = 10 bar，P z = 1 bar)。從壓縮軌跡中提取兩種不同曲率的膜，盒子尺寸分別為 58.9 × 29.5 × 25.9 nm 3(多余膜面積 = 25.1 nm 2)和 56.3 × 28.2 × 28.3 nm 3(多余膜面積 = 31.4 nm 2)。
在這兩個系統(tǒng)中，蛋白質(zhì)都被放置在彎曲膜上方并重新溶劑化和電荷中和。使用上述設(shè)置進(jìn)行簡單平衡，并以f c = 1000 kJ mol -1 nm -2維持對蛋白質(zhì)的位置限制。平衡運行 250 ns。然后使用具有固定x、y尺寸和P z = 1 bar 的各向異性壓力耦合進(jìn)行生產(chǎn)模擬。生產(chǎn)模擬進(jìn)行了 30 µs。使用與上面相同的模擬參數(shù)，除了使用耦合時間為 20 ps 87的 Parrinello-Rahman 恒壓器來控制壓力。
圖像和可視化是使用 VMD(版本 1.9.4)88制作的。使用 MDAnalysis 1.1.1 89、90和 python 3.6進(jìn)行分析。為了分析彎曲膜上蛋白質(zhì)的曲率偏好，Bhaskara 等人先前建立了協(xié)議。使用了17 (參見：https: //github.com/bio-phys/MemCurv)。通過優(yōu)化最小二乘擬合，每 1 ns 將高度函數(shù)h (x,y) 的二維傅里葉展開擬合到膜的磷酸鹽珠上。隨后，從擬合高度函數(shù)h ( x , y )的形狀算子導(dǎo)出平均曲率 H 。計算蛋白質(zhì)質(zhì)心的x、y位置以及隨機(jī)選擇的磷酸鹽珠位置的平均曲率 H，以在每個考慮的幀對背景膜進(jìn)行采樣。
掃描電子顯微鏡 (SEM)
10 nM fMLP 刺激 30 分鐘后，通過直接添加 37 °C 雙倍強(qiáng)度固定劑(0,1 M PHEM 中的 5% GA)將細(xì)胞固定在 0,1 M PHEM 緩沖液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至細(xì)胞培養(yǎng)基。孵育10分鐘后，用新鮮的單濃度固定劑替換固定劑，并在室溫下進(jìn)一步固定細(xì)胞1小時。固定后，將細(xì)胞在0.1M PHEM中洗滌2次，并在0.1M二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌2次。接下來，將它們在新鮮制備和過濾的 1% OsO 4 (#19190，EMS) 和 0.8% 亞鐵氰化鉀 (K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984，Merck)中后固定 2 小時。在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中。后固定后，將細(xì)胞在H 2 O中洗滌4次，并置于4°C直至進(jìn)一步處理。
接下來，使用 Pelco BioWave 微波爐，用新鮮制備并過濾的 1% 單寧酸(TA，CAS#1401-55-4，EMS)水溶液處理細(xì)胞，在 150 W 和 0 W 功率之間交替進(jìn)行七個 1 分鐘循環(huán)。穩(wěn)定溫度設(shè)置為 23 °C，所有步驟均開啟真空。TA 處理后，在工作臺上用H 2 O洗滌細(xì)胞 2 次，并在微波爐中用H 2 O 洗滌 2 次，每步 40 秒，功率為 250 W。然后使用與 TA 相同的微波程序，用 1% UA (#77870, Serva) 的 H 2 O溶液處理細(xì)胞。在 H 2 O 中洗滌一次并在 25% EtOH 中洗滌兩次后，使用具有步長的微波程序在分級系列乙醇 (25%–50%–75%–90%–100%–100%) 中脫水40 秒和 250 W 功率，穩(wěn)定溫度為 4 °C，無真空。最后，使用具有 6 個微波程序的乙醇 (25%–50%–75%–100%–100%) 溶液梯度系列六甲基二硅氮烷(HMDS，CAS# 999-97-3，Sigma Aldrich)浸潤細(xì)胞。每個步驟 1 分鐘，步驟 1、3、4 和 6 的功率為 150 W，步驟 2 和 5 的功率為 0 W。最終 100% HMDS 滲透后，除去所有 HMDS，并讓蓋玻片干燥過夜。將帶有水分指示劑的硅膠(Merck)添加到24孔板的4個空孔(角落)中以除去多余的濕度。
干燥后，使用碳帶將蓋玻片安裝在鋁棒(Agar Scientific G301F)中，并使用 Q150RS 型 Quorum 濺射鍍膜機(jī)在 30 mA 電流下濺鍍一層金，持續(xù) 180 秒。
成像在 Zeiss Crossbean 540 顯微鏡上進(jìn)行，使用 5 kV 加速電壓和 700 pA 電子束電流，工作距離為 5 mm。使用二次電子探測器 (SESI) 進(jìn)行信號檢測，所有圖像均以 28.9 nm/像素的像素大小獲取。
串行塊面掃描電子顯微鏡 (SBEM)
在 MatTek 培養(yǎng)皿中進(jìn)行 10 nM fMLP 刺激 30 分鐘后，通過直接添加 37 °C 雙倍強(qiáng)度固定劑(0.1 M PHEM 中的 5% GA)將細(xì)胞固定在 0.1 M PHEM 緩沖液中的 2.5% GA(#16220，EMS)中 1 :1 至細(xì)胞培養(yǎng)基。孵育 10 分鐘后，用新鮮的單一強(qiáng)度固定劑替換固定劑，并將細(xì)胞在固定劑中于 4 °C 孵育過夜。固定后，將細(xì)胞在 0.1 M PHEM 中洗滌 2 次，并在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中洗滌 2 次。接下來，將它們在 1% OsO 4 (#19190, EMS) 和 0.8% 亞鐵氰化鉀(新鮮制備并過濾)中的冰上后固定 1.5 小時(K 4 [Fe(CN) 6 ]*3H 2 O，#4984， Merck)在 0.1 M 二甲胂酸鹽緩沖液中。后固定后，將細(xì)胞在H 2 O中洗滌4次，并留在4℃的H 2 O中直至進(jìn)一步處理(5天)。
接下來，按以下順序連續(xù)三個步驟對細(xì)胞進(jìn)行染色：1% 硫代碳酰肼(TCH，#21900，EMS)水溶液、2% OsO 4水溶液和 1% UA(#77870，Serva)水溶液。對于所有三個染色步驟，細(xì)胞均在 Pelco BioWave 微波爐中處理，每個程序分為 7 步，功率在 100 W 和 0 W 之間交替(從 100 開始)，穩(wěn)定溫度設(shè)置為 23 °C，真空開啟所有步驟。在每個染色步驟之間，將細(xì)胞在 H 2 O 中洗滌 4 次，在工作臺上洗滌兩次，在微波爐中洗滌兩次(40 秒，250 W 功率，真空關(guān)閉)。
UA染色后，將細(xì)胞在H 2 O中洗滌一次，在25% EtOH中洗滌兩次，然后在分級乙醇系列(50%–70%–90%–100%–100%)中進(jìn)一步在微波中脫水。脫水步驟的微波設(shè)置為：時間 40 秒，功率 250 W，真空關(guān)閉，穩(wěn)定溫度 4 °C。
脫水后，將細(xì)胞浸潤到乙醇(25%–50%–75%–100%–100%–100% durcupan)中的分級系列 durcupan 樹脂(來自 Sigma 的 Durcupan ACM，#44611-#44614(四種成分))中)，使用微波，每步 3 分鐘，功率 150 W，23 °C 穩(wěn)定溫度和真空循環(huán)。
最后，將細(xì)胞放在少量新鮮樹脂上(覆蓋 MatTek 培養(yǎng)皿的中心)并放置約 1-2 小時以蒸發(fā)殘留溶劑和氣泡。在聚合之前，除去大部分樹脂(僅留下足以覆蓋中心的樹脂)。將一滴 durcupan 添加到 18 × 18 mm 蓋玻片中(以避免滯留氣泡)，然后將蓋玻片放在 MatTek 培養(yǎng)皿中心的頂部。該組件在 60°C 的烘箱中聚合 2 天。
聚合后，通過鋸切靠近蓋玻片移除MatTek盤，并通過將組件浸入液氮和溫水中移除圓形中心和平兩側(cè)的玻璃。
使用刀片從樣品中切下一小塊，并使用雙組分銀導(dǎo)電環(huán)氧樹脂(Ted Pella，#16043)安裝在 SEM 針(Micro to Nano Gatan 3View 針，#10-006003-50)上。樣品的側(cè)面還覆蓋有銀環(huán)氧樹脂，最后使用 Q150RS 型 Quorum 濺射鍍膜機(jī)在 30 mA 電流下濺鍍一層金，持續(xù) 180 秒。為了固化銀環(huán)氧樹脂，樣品在 60 °C 下總共固化了一天。
圖像采集在帶有 Gatan 3View 的 Zeiss GeminiSEM 450 上進(jìn)行(DigitalMicrograph 版本 3.51.3720.0；SmartSEM 版本 6.06，帶有 Service Pack 4)，安裝了用于控制采集的程序 SBEM Image (2021.08.dev) 91。對于圖像采集，使用 1.5 kV 的加速電壓、300 pA 的束流、10 nm 的像素尺寸和 1.6 µs 的停留時間。使用點 BSE 檢測器進(jìn)行檢測，對比度設(shè)置為 99.9%，亮度設(shè)置為 11.8(帶倒置 LUT)，BSD 偏置為 -5 V。切片厚度設(shè)置為 40 nm。在每個周期之間，以 165.76 nm 像素大小和 0.8 µs 停留時間采集概覽圖像。
統(tǒng)計分析
使用 R(版本 3.2.1)進(jìn)行統(tǒng)計分析，同時使用 R 和 Adob??e Illustrator® 進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化。數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性通過Shapiro-Wilk檢驗進(jìn)行檢驗。雙尾t檢驗用于正態(tài)分布。否則，如果沒有不同說明，則使用非參數(shù) Mann–Whitney- U檢驗。在所有箱線圖中，下鉸鏈和上鉸鏈對應(yīng)于第一和第三四分位數(shù)(第 25 個和第 75 個百分位數(shù))。上須線從鉸鏈延伸到最大值，但不超過 1.5*IQR(第一四分位數(shù)和第三四分位數(shù)之間的距離)。下部須線從鉸鏈延伸至最小值，但不低于鉸鏈的 1.5*IQR。晶須末端以外的數(shù)據(jù)繪制為黑點。黑線和點分別對應(yīng)于中位數(shù)和平均值。所有測量均取自不同的樣品。
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